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黄曲霉探针法荧光定量 PCR 试剂盒

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黄曲霉探针法荧光定量 PCR 试剂盒

【产品及特点】

黄曲霉(Aspergillus flavus.),半知菌类,一种常见腐生真菌。多见于发霉 的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织 (WHO)的癌症研究机构划定为 1 类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲 霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至 死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素 b1 最为多见。其毒性和致癌性也最强。 因此快速检测黄曲霉具有重要意义,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据黄曲霉高度保守区设计,不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6.  本只能用于科研,足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。

【规格及成分】

成分

编号

十孔盒包装

2×Probe qPCR MagicMix

试剂一

500 μL(本色盖)

荧光PCR专用模板稀释液

试剂二

1 mL(黄盖)

黄曲霉探针法 qPCR 引物混合 液

试剂三

100 μL(白盖)

黄曲霉 qPCR 探针

试剂四

50 μL(棕色管)

黄曲霉探针法 qPCR 阳性对照2.0(1×10E8 拷贝/μL)

试剂五

50 μL(黄盖)

使用手册   1 份

【运输及保存】 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。

【自备试剂】 样品DNA 。

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2.  用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头, 下同)。

3.  7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 

一、样品 DNA 的制备

1. 如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

2. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数真菌 DNA 提取试剂 盒兼容。也可以选购本公司的真菌 DNAout 或柱式真菌 DNAout。

二、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行) 

9. 如果进行定量分析,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线样品。如果做定 性分析,则 6 个标准曲线样品只选一个做(可以选 4 号,其余样品不变)。 以下只介绍定量分析的反应设置。   

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加):

成分

样品管N+2个

PCR阴性对照管

标准曲线样品管(2-7管)

2×Probe qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

黄曲霉探针法 qPCR 探针

1 μL

1 μL

各 1 μL

黄曲霉探针法 qPCR 引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 个待测样品 DNA 模板

6 μL

-

-

超纯水

-

6 μL

-

第 7 步所得标准曲线样品稀释液

(2-7 号)

-

-

 

各6μL(2 号样到2号管,3 号样到3号管…)

  11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程

温度

时间

预变性

94℃

5 min

PCR 反应

(40个循环)

94℃

 

15sec

55℃

0.5 min(采集 FAM 通道的荧 光信号)

72℃

0.5 min

数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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