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枯草芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 XY161T

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  • 枯草芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒 XY161T

    ¥3960.00

枯草芽孢杆菌荧光定量 PCR 试剂盒

【产品及特点】

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),是芽孢杆菌属的一种。革兰氏阳性菌, 可形成内生抗逆芽孢,芽孢 0.6-0.9×1.0-1.5 微米,椭圆到柱状,位于菌体中 央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快,菌落表面粗糙不透明, 污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭,是一种需氧菌。可利用 蛋白质、多种糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛,对此 菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的 有机物中,易在枯草浸汁中繁殖。有的菌株是α淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产 菌;有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系,故常作选育核苷生产菌的亲株或制取 5'-核苷酸酶的菌种。因此快速灵敏检测枯草芽孢杆菌有重要意义。

本产品就是以 探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测枯草芽孢杆菌的试剂盒。

它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据枯草芽孢杆菌高度保守区设计。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

【规格及成分】

成分

编号

五孔盒包装

2×Probe qPCR MagicMix

试剂一

0.5 mL

荧光PCR专用模板稀释液

试剂二

1 mL

枯草芽孢杆菌探针法 qPCR 引物 混合液

试剂三

100μL

枯草芽孢杆菌 qPCR 探针

试剂四

50 μL

枯草芽孢杆菌探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)

试剂五

50 μL

使用手册


1份

【运输及保存】 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。

【自备试剂】 样品DNA 。

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品(10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头, 下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加):

成分

样品管 N+2个

PCR阴性对照管

标准曲线样品管

(1-6管)

2×Probe qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各10 μL

枯草芽孢杆菌 qPCR 探针

1 μL

1 μL

各1 μL

枯草芽孢杆菌探针法 qPCR 引物 混合液

2 μL

2 μL

各2 μL

N+2 个待测 DNA 模板

7 μL

不加

不加

超纯水

不加

7 μL

不加

第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号)

不加

不加

各 7 μL(2 号样

到 2 号管,3 号样到 3 号管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

5 min

PCR反应

(40个循环)

95℃

15sec

60℃

60sec(采集FAM通道的荧光信号)

四 、 数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于

30。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 28。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性,如果小 于或等于 28 则为阳性。如果在 28-30 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 30,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。


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