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你知道什么是无血清培养基?

在细胞培养中大多数动物细胞体外培养时都需要加入血清提供营养,但由于血清存在很多潜在风险,促使科学家们进行无血清驯化细胞的研究。所以,在1976 年Hayashi 等人提出了无血清培养基的概念,此后,大量生物医药学家开始对无血清培养基进行研制。80 年代后,无血清培养基的研究与制备广泛发展,到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。与传统的培养基相比较,无血清培养基是不含动物血清,但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚,制备过程简单,在现代生物技术学领域得到广泛应用。

无血清培养基的优势
superiority

1.可避免血清批次间的质量变动,提高细胞培养和实验结果的重复性。

2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清组分对实验研究的影响。

4.有利于体外培养细胞的分化。

5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

无血清培养基的缺点
shortcoming

1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。

2.成本较高。

3.针对性很强,一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

无血清与血清体系培养脐带间充质干细胞比较
shortcoming

实验材料:

DMEM/F12培养基、胎牛血清、无血清培养基、

CD14-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD79a-PE、HLA-DR FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、MTT、DMSO、油红О、碱性磷酸酶试剂盒等

实验方法:

1.人脐带间充质干细胞的分离、培养及扩增

2.细胞生长活性测定

3.细胞表面标志的鉴定

4.MSCs诱导分化

实验结果:

细胞形态学观察

  无血清培养组在培养第10天可见少量细胞迁出,细胞呈纺锤形、长梭形、多角形、逗号等形态。原代培养第12天细胞融合达到约70%(见图1),大部分细胞呈纺锤形和长梭型,少量细胞呈多角形。传代后细胞生长速度加快,纯度提高,以平行排列生长为主或呈旋涡状生长(见图2)。约2~3天后可再传代。


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图1 无血清培养原代第12天(40×)


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图2 含血清培养原代12天(40×)


        血清组在培养第10天可见部分细胞迁出,细胞形态与无血清组无异,细胞生长度速度较无血清组稍快。原代培养第12 天细胞融合达到约80%(见图2),细胞形态与无血清组无异。传代后细胞生长速度和细胞纯度均有明显提高,亦呈平行排列生长或漩涡状生长(见图3)。约2~3天后可再传代。


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图3 无血清培养P2代第二天(40×)


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图4 含血清培养P2代第二天(40×)

细胞生长活性测定

        横轴为培养时间(以每天计),纵轴为OD值绘制生长曲线。细胞接种1~2天为缓慢生长的潜伏期,从第3天即进人对数生长期,两种培养基培养的细胞都从第5天进入平台期,细胞倍增时间为30 h,P>0.05,两种培养基培养的细胞增殖曲线无显著差异(见图5)。后可再传代。


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图5 两种培养基培养的细胞增殖曲线

细胞表面标志分析

        流式细胞术分析表明,无血清培养基和含血清培养基培养的脐带 MSCs均高表达粘附分子和基质细胞标记CD73,CD90,CD105,不表达造血细胞标记CD14,CD34,CD45, CD79a(图6),不表达

主要组织相容性复合物类分子HLA-DR。显著差异(见图5)。

后可再传代。


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图6 两种培养基培养的细胞表面标志比较

体外诱导分化

        经成脂诱导2周后,P2代人脐带 MSCs可以分化为脂肪细胞。进行油红О染色,可见胞浆中有大量被染成红色的脂滴(见图7)。


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图7 人脐带MSC油红O染色结果(400×)


        经成骨诱导2周后,2代人脐带 MSCs可以分化为成骨细胞。进行碱性磷酸酶染色,可以看见大量紫色沉淀(见图8)。


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图8 人脐带MSC碱性磷酸酶染色结果(400×) 

总结

        研究利用无血清培养基成功分离培养出脐带 MSC,和含血清培养基培养出的细胞具有相似的生物学特性,完全可以替代含血清培养基。随着国家《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》等文件出台,对于培养基成分提出了严格要求,可以预见未来无血清培养将在临床干细胞培养领域占据主导地位,具有广阔的应用前景。


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