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BCA法蛋白定量试剂盒 XY90095DY

BCA protein quantitative kit

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BCA法蛋白定量试剂盒

产品及特点 本产品是基于 BCA 法(bicinchoninic acid,二奎啉甲酸法)蛋白检测原 理开发的蛋白质浓度测定产品,BCA 法跟 Lowry 法的第一步完全相同,就是在 碱性条件下,蓝色的 Cu2+被蛋白质还原成紫色的 Cu+。此反应类似 Cu2+与 Biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2,双缩尿)发生的反应,故又叫 Biuret 反应(Biuret 反应本省就可以测定蛋白质浓度,目前仍然是医院血液蛋白定量的方法)。第二 步,Cu+与 BCA 发生反应形成水溶性的紫色化合物,通过分光在 562 nm 处测 定紫色化合物的量就可以精确定量蛋白质浓度。BCA 检测灵敏度比 Biuret 反应 高 100 倍左右。

此方法的特点如下。

1. 对各种常见的去污剂不敏感,但对 Cu 的还原剂和螯合剂比较敏感。

2. 比 Lowry 法更加简单快捷,45 分钟内完成测定。

3. 试剂稳定,室温可以放置两年。工作液 1 天内有效。

4. 线性范围在 20~2000 µg/mL。如果需要范围在 0.1-10ug/mL,需要选 用超敏 BCA。

5. 最小测量体积为 1-20 uL。

6. 终产物稳定,变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

7. 可以检测最短到双肽,而 Bradford 法需要一定大小的蛋白质。

8. 有常规(试管)和微量(96 孔板)两种检测模式。

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存,但 BSA 标准品需要低温运输,-20℃保存,有效期两年。

自备试剂 样品缓冲液

使用方法 一:96 板操作模式

1、 取一块 96 孔板,先进行编号(编号可以根据样品数增加),并按照下表加入 BSA 标准,待测样品和溶解待测样品的缓冲液(可以用水替代):

2、 计算 BCA 工作液需要量:根据样品数量(包括制备标准曲线的样品的数量) 和每个样品需要 0.2 mL BCA 工作液的比例,计算所需 BCA 工作液的用量, 然后加上 10%损耗作为实际需要配制的量。例如:计算出需要 5mL 工作液, 实际按不少于 5.5 mL 的量配制。

3、 配制 BCA 工作液:按 50 体积溶液 A 加 1 体积溶液 B(50:1)的比例将二 者充分混合,所得溶液即 BCA 工作液。比如:5 ml 溶液 A + 100 µl 溶液 B。注意:取用溶液 A 和溶液 B 前需要充分摇匀,溶液 B 非常容易形成沉淀, 需要 65℃加热溶解后才能使用。当把溶液 B 刚加入到溶液 A 中时,最初会 出现淡绿色沉淀,轻微晃动沉淀即会消失,工作液最后成绿色,可以室温放 置 12 天,但需要将容器的盖子拧紧。

4、 将 10 倍体积(20μL 的 10 倍体积即 0.2 mL)的 BCA 工作液加入到各孔中 并混匀。也可把 96 孔板放在振荡器上振荡 30 秒混匀。

5、 37℃放置 30 分钟。

6、 冷至室温,10 分钟内完成后续测定,否则化学反应还在继续进行,使光吸 收值慢慢升高,每 10 分钟会升高 2.5%左右。

7、 在 562 nm 下比色测定样品的光吸收。如酶标仪没有 562 nm 的设定,可 用接近的波长检测,如 570 nm。

8、 将编号为 0 号的样品(对照)的读数从其余所有样品(包括 0 号样品,其读 数变成零)中扣除。

9、 以 0-7 号样品的 BSA 含量(μg,见上表最右行)为横坐标,以样品的吸光 值为纵坐标,绘出 BSA 的标准曲线。

10、再将待测样品的吸光值(减去 0 号样品的读数后的值)标在标准曲线上,其 在横坐标上对应的蛋白含量(μg)就是待测样品中的蛋白质含量,除以样品 稀释液总体积(20 μL),乘以样品稀释倍数即为样品浓度(μg/μL)。

二:试管测定模式

1、 基本操作同上,只是操作改在编号的玻璃试管中进行,同时 BSA 标准品 (2ug/uL)的使用量从低到高改为 0、5、10、20、40、60、80、100uL, 样品的总体积从 20uL 改为 100uL,BCA 工作液的用量从每个样品 0.2 mL 改为 2 mL。

三:注意事项

1、 BCA 法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应 会因温度升高而加快。所以,如果蛋白质浓度较低,可以改在 60℃孵育 30 分钟或更长。

2、 待测样品浓度在 20~2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

3、 在一定浓度范围内 BCA 法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响:

4、 本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响,所以需确保 EDTA 浓度不高于 10mM,二硫苏糖醇不高于 1mM,β-巯基乙醇不高于 1mM,没有任何 EGTA,否则建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。

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