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1.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-) XY9A0678

1.1×即用型PCR预混液,保真度为Taq的30倍,极速延伸(10~15 s/kb),不含电泳指示剂

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1.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-)

产品组成

组分规格
1.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-) 5×1.125 mL

保存条件

-20℃保存 24 个月。

产品简介

本产品为 1.1×即用型快速 PCR 预混液,内含 S4 Fidelity DNA polymerase、dNTPs 以及优化的缓冲体系,只需添加引物和模板即可进行扩增,可有效扩增 5 kb 以内的 DNA 片段。

该酶具有 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性,扩增产物为平末端,可直接用于平末端克隆。

产品特点

操作简单:1.1×即用型预混液,无需添加 ddH2O,最大程度地减少实验步骤;

高保真:保真度为野生型 Taq 酶的 30 倍;

极快的延伸速度:10~15 s/kb;

超高的耐热性能:98℃热处理 1 h 后聚合酶活性无明显变化。

适用范围

本产品适用于以试剂盒提取的基因组 DNA、cDNA 和质粒 DNA 的 PCR 扩增,如基因鉴定、基因克 隆等实验。

注意事项

1. 本产品为 1.1×PCR 预混液,无需额外添加 ddH2O。每次反应中该产品用量至少应占到总反应体积的 85%,50 μL 体系至少使用 43 μL PCR Mix,25 μL 至少使用 21 μL PCR Mix;

2. 请使用高质量的模板进行扩增,如试剂盒提取的基因组 DNA。请勿使用 dUTP 或含尿嘧啶的引

3. PCR Mix 应避免反复冻融,短期内多次使用可置于 4℃保存。

使用方法

操作示例

按下表配制 PCR 反应体系(冰上操作)

组分25 μL 体系50 μL 体系终浓度
1.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-)a21~22 μL43~45 μL
Primer 1 (10 μM)b1.0 μL2.0 μL0.4 μM
Primer 2 (10 μM)b1.0 μL2.0 μL0.4 μM
Template DNAc1~2 μL1~3 μL

a. 当需要加入较多的模板时,可相应调整本产品用量,但本产品占比不可低于总体系的 85%,Mix 含量过低会降低扩增效率。本产品推荐 45 μL/50 μL 扩增体系;

b. 引物终浓度范围为 0.2~0.8 μM,推荐 0.4 μM,过少的引物会导致扩增失败或产量极低,过量的引物会增加错配的可能性,导致非特异性扩增;

c. 模板推荐量:

试剂盒提取的基因组 DNA:50~500 ng;

质粒、噬菌体 DNA:0.05~1 ng;

cDNA:推荐将反转录产物原液稀释 5~10 倍后,取 1~2 μL 作为模板。

(注:过量的模板会导致非特异性扩增,过少的模板易导致 PCR 扩增效率低。)

建议的 PCR 条件

步骤温度时间循环数
预变性 a98℃2 min1
变性98℃10 s30~35 cyclesf
退火Tmb10~15 sc
延伸72℃d10~15 s/kbe
终延伸72℃1~5 min1
-4℃Hold-

a. 预变性:扩增较长的片段时,建议使用 95℃ 5 min 预变性处理防止对 DNA 造成额外的损伤;

b. 退火温度:参考引物 Tm 值,最适退火温度与引物间的平均 Tm 值相近,若引物间 Tm 值偏差较大,建议退火温度设置为引物中 Tm 较小值+1~2℃;

(值得注意得是,若引物上添加有与模板不匹配的碱基序列,如酶切位点、同源臂等,PCR 程序设置退火温度时,仅需计算与模板特异性匹配的引物序列的 Tm 值。)

c. 退火时间:对于含兼并引物、复杂模板的扩增,建议退火时间延长至 30 s;

d. 延伸温度:通常为 72℃,可根据实际需求在 68~75℃范围内调整;

e. 延伸时间:常规模板推荐设置为 10~15 s/kb,复杂模板可以将延伸速度增加至 20~30 s/kb;略微增加延伸时间有利于提高长片段、低浓度、复杂模板的 PCR 产量,但总延伸速度不超过 30 s/kb;

f. 循环数:30 个循环可满足大部分扩增需要,循环数过多易导致非特异性扩增,若扩增条带较弱,可将循环数增加至 35~40 个。

常见问题与解决办法

Q1:扩增无产物或产物量少?

A1:

1) 模板降解或模板纯度差。电泳检测模板质量,使用高质量模板;

2) 模板浓度过低。适当增加模板用量;

3) 引物不合适。优化引物设计;

4) 退火温度不合适。设置退火温度梯度,摸索合适的退火温度;

5) 循环数过少。适当增加 5~10 个循环;

6) 延伸时间不足。复杂模板可适当增加延伸速度至 20~30 s/kb。

Q2:扩增出现非特异条带或弥散带?

A2:

1) 引物特异性差。优化引物,避免非特异性条带以及引物二聚体的扩增;

2) 引物浓度过高。降低引物浓度;

3) 模板过量或纯度差。减少模板量,使用高质量模板;

4) 退火温度过低。适当提高退火温度或使用 Touchdown PCR 程序;

5) 循环数过多。减少循环数至 25~30 cycles。

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