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SPF级大小鼠病原体质量控制多重Rt-qPCR联检试剂盒（国标病毒必检八项）（探针法）
产品说明
SPF级大小鼠国标必检病毒qPCR联检试剂盒，采用Taqman荧光定量PCR技术，专为在多种样本类型中快速、高灵敏地筛查SPF级大小鼠常见的8种病毒而设计。
本试剂盒采用一步法RT-qPCR，设计8套引物探针分别在FAM（Ⅲ型呼肠孤病毒Reo-3（RNA）、仙台病毒SV（RNA）、小鼠肝炎病毒MHV （RNA）），HEX（汉坦病毒HANT（RNA）、小鼠肺炎病毒PVM（RNA）、小鼠细小病毒MVM（DNA）），ROX（大鼠细小病毒KRV（DNA）、大鼠细小病毒H-1（DNA））三个通道检测8种病毒，另外一套引物探针在CY5通道检测内参RNA。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：检测灵敏度较高，10 copies/μL可被有效检出。
高效：单管一次可筛查8种病原菌。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
可靠：含内参对照，避免假阴性。
方便：操作简单，一步法检测。
运输及保存条件
低温冷冻运输，-20℃保存，有效期1年；使用后仍存放在-20℃，不可反复冻融超过三次。
产品组分
A BOX:
| 组分名称 | 装量 |
| Virus qPCR Reaction Mix | 110 μL×2管 |
| Required Virus Primer&Probe Mix | 冻干粉×2管 |
| RNase Free Water | 1.1 mL×2管 |
| 石蜡油 | 1.1 mL×1管 |
B BOX:
| 组分名称 | 装量 |
| 阳性质控1（PC1） | 冻干粉×2管 |
| 阳性质控2（PC2） | 冻干粉×2管 |
| 阳性质控3（PC3） | 冻干粉×2管 |
| RNase Free Water | 1.1 mL×1管 |
注：
（1）阳性质控（PC1）包含4种病毒核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是Ⅲ型呼肠孤病毒Reo-3、汉坦病毒HANT、大鼠细小病毒KRV、内参RNA。
（2）阳性质控（PC2）包含4种病毒核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是仙台病毒SV、小鼠肺炎病毒PVM、大鼠细小病毒H-1、内参RNA。
（3）阳性质控（PC3）包含3种病毒核酸或含特定片段的质粒DNA，分别是小鼠肝炎病毒MHV、小鼠细小病毒MVM、内参RNA。
【操作步骤】
1. 样本制备
推荐配套使用信裕生物SPF-Level Mouse/Rat Pathgen DNA/RNA Kit Pro，此试剂盒提取快速，回收率较高，并提供核酸保护剂（含内部质控），可以对提取过程进行质控，若使用其他提取试剂盒需先自行测试。
2. 产品组分的复溶
A BOX：Required Virus Primer&Probe Mix先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5 s，室温放置5-10 min备用。
| A BOX： | 每管需加入RNase Free Water量 |
| Required Virus Primer&Probe Mix | 302 μL |
| 注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。 | |
B BOX：阳性质控１（PC1）、阳性质控2（PC2）、阳性质控3（PC3）先12,000 rpm离心5 min，按下表加入RNase Free Water，涡旋震荡1 min，瞬离5 s，室温放置5-10 min备用。
| B BOX： | 每管需加入RNase Free Water量 |
| 阳性质控1（PC1） | 44 μL |
| 阳性质控2（PC2） | 44 μL |
| 阳性质控3（PC3） | 44 μL |
| 注：A、B BOX复溶分别用盒中所给的RNase Free Water，请勿混用、复用，避免污染；阳性质控务必与A BOX分开保存，防止污染，复溶后立即通风并喷洒酒精，以防气溶胶污染；产品组分复溶后建议-20℃保存，反复冻融不超过三次，可分装后储存。 | |
3. qPCR 反应液的准备
（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做单孔。
反应孔数=3个阳性质控+1个阴性质控+样本数
（2）根据反应孔数计算所需的Virus Probe qPCR Mix总量（需有1孔的加样损失量）：
Virus Probe qPCR Mix=（反应孔数+1）×15 μL
（3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备qPCR Mix：
| 组分/样品管 | Virus qPCR Reaction Mix (µL) | Required Virus Primer&Probe Mix (µL) | 总体积 (µL) |
| 1孔 | 4 | 11 | 15 |
| N孔 （反应孔数+1） | 4N | 11N | 15N |
4. qPCR 反应体系及反应条件
（1）震荡混匀Virus Probe qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装15 μL qPCR Mix。
（3）向分装过qPCR Mix的反应管中加入15 μL石蜡油。
（4）向反应管中加入样品，3,000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：
| 组分/样品管 | 待测样品管 (µL) | 阳性对照管1 (µL) | 阳性对照管2 (µL) | 阳性对照管3 (µL) | 阴性对照管 (µL) |
| Virus Probe qPCR Mix | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| RNase Free Water | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| Sample | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 阳性质控1（PC1） | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| 阳性质控2（PC2） | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 |
| 阳性质控3（PC3） | 0 | 0 | 0 | 5 | 0 |
PCR仪设置以宏石SLAN-96S为例，先新建并保存程序项目，选择定性/绝对定量模式，反应体系20 µL，选择FAM、HEX、ROX、CY5通道，按照下表设置程序进行保存：
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | |
| 1 | 逆转录 | 1 | 55℃ | 15 min |
| 2 | 预变性 | 1 | 95℃ | 30 s |
| 3 | 变性 | 35/40 | 95℃ | 10 s |
| 退火与延伸 | 60℃ | 30 s | ||
| 60℃延伸时收集荧光信号 | ||||
| 通道选择：样本检测通道-FAM、HEX、ROX；内参检测通道-CY5。宏石SLAN-96S荧光定量 PCR 仪不需 ROX 校准。若存在部分荧光定量PCR仪无CY5通道，即不分析该通道。 | ||||
注：反应热程序DNA/RNA皆适用。样本类型为粪便/盲肠内容物时变性、退火/延伸进行35个循环扩增，其他样本类型变性、退火/延伸进行40个循环扩增。
【阈值设置】
以宏石SLAN-96S为例，常用选项中扩增曲线算法选择相对荧光值法-log，基线设置3-15个循环。
（1）按照机器的自动阈值或者手动调整阈值线将阳性质控（PC）各通道的Ct值定为≤32，根据该阈值线进行检测样本结果的判定。
【结果判读】
以宏石SLAN-96S为例，根据样本（FAM/HEX/ROX）Ct值判定是否发生病毒感染，具体标准如下：
| PCR 模板 | 样本（FAM/HEX/ROX） | 判定说明 |
| 阳性对照 （1、2、3） | ≤32 | 阳性成立 |
| ＞32 | 阳性不成立 | |
| 待测样品 | ＞35（粪便/盲肠内容物） | 阴性成立 |
| ＞40（组织、血液、垫料/粉尘） | ||
| ≤35（粪便/盲肠内容物） | 阳性成立 | |
| ≤40（组织、血液、垫料/粉尘） |
注：
样本阳性判断标准为：
（1）粪便/盲肠内容物样本Ct值≤35时，判定为阳性。其中FAM通道Ct值≤35时，样本可能感染Ⅲ型呼肠孤病毒Reo-3、仙台病毒SV、小鼠肝炎病毒MHV中的一种或几种；HEX通道Ct值≤35时，样本可能感染汉坦病毒HANT、小鼠肺炎病毒PVM、小鼠细小病毒MVM中的一种或几种；ROX通道Ct值≤35时，样本可能感染大鼠细小病毒KRV、大鼠细小病毒H-1中的一种或两种。
（2）组织、血液、垫料/粉尘样本Ct值≤40时，判定为阳性。其中FAM通道Ct值≤40，样本可能感染Ⅲ型呼肠孤病毒Reo-3、仙台病毒SV、小鼠肝炎病毒MHV中的一种或几种；HEX通道Ct值≤40，样本可能感染汉坦病毒HANT、小鼠肺炎病毒PVM、小鼠细小病毒MVM中的一种或几种；ROX通道Ct值≤40，样本可能感染大鼠细小病毒KRV、大鼠细小病毒H-1中的一种或两种。
（3）不同机器的检测灵敏度不同，不同类型样本性质不同，建议使用该系列试剂盒检测样本前，利用SPF样本进行适应性验证后制定阳性判断标准。
若各通道有阳性出现，建议进一步使用鉴定试剂盒进行单一病毒感染确认：
（1）FAM通道阳性：使用试剂盒，对三种可能感染的病毒（Ⅲ型呼肠孤病毒Reo-3、仙台病毒SV、小鼠肝炎病毒MHV）进行确认。
（2）HEX通道阳性：使用试剂盒，对三种可能感染的病毒（汉坦病毒HANT、小鼠肺炎病毒PVM、小鼠细小病毒MVM）进行确认。
（3）ROX通道阳性：使用试剂盒，对两种可能感染的病毒（大鼠细小病毒KRV、大鼠细小病毒H-1）进行确认。
检查内参通道扩增是否正常，内参扩增不正常，表明核酸抽提过程有误或者PCR反应未正常进行，需重复检测。
【注意事项】
由于PCR反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生核酸污染。
建议分区操作
（1）A区：（洁净区）配制Mix和qPCR阴性加样，建议在超净工作台完成，并配套干净器具及无菌无酶耗材专用于体系配制。
（2）B区：（核酸提取及加样区）样本DNA/RNA提取，建议在超净工作台完成，若无超净工作台请通风状态下提取并立即消杀，需配套专用于核酸提取的器具，并在每次提取后对环境和器具进行核酸消杀处理；加样区，按照先加待测样本，后加阳性对照的顺序加样，在qPCR反应板上阳性对照的排布应远离待测样本孔和阴性对照；同样需配套专用于加样的仪器，并在每次加完样后进行核酸消杀处理。
（3）C区：（核酸扩增区）此区域放置荧光定量PCR仪及相关电脑进行数据处理，同样需定期进行核酸消杀。
其他
（1）由于B BOX含阳性质控，为避免试剂受到核酸污染，A、B BOX请分开储存。
（2）每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
（3）qPCR反应板封膜或盖盖子时需反复压紧。
（4）上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底。
（5）盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。