小鼠活性氧（ROS） 酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 96T 

检测范围： 20 IU/ml -500 IU/ml

使用目的： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样 本中活性氧（ROS）含量。 

实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠活 性氧（ROS）水平。用纯化的小鼠活性氧（ROS）抗 体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中 依次加入活性氧（ROS），再与 HRP 标记的活性氧 （ROS）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物， 经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的 催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄 色。颜色的深浅和样品中的活性氧（ROS）呈正相关。 用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通 过标准曲线计算样品中小鼠活性氧（ROS）浓度。

试剂盒组成： 

样本处理及要求：

1.血清： 室温血 液自然 凝固 10-20 分钟，离心 20 分 钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存 过程中如出现沉淀，应 再次离心。

2.血浆：应根据标本的要 求选择 EDTA 或柠檬酸 钠作 为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分 钟 左 右 （2000-3000 转/分) 。仔细收集上清 ，保存过程中如 有沉淀形成，应该再次 离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成， 应再次离心。胸腹水、 脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收 集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细 收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4 ） 稀释细胞悬液，细胞 浓度达到 100 万 /ml 左右。 通 过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。 保存过程中如有沉淀形 成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ，PH7.4。用液氮 迅速冷冻保存备用。标本融化后 仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4）， 用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右 （2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行， 提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将 标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.不能检测 含 NaN3 的样品， 因 NaN3 抑制辣根过氧 化物酶的（HRP ）活性。

 操作步骤：

1. 标准品：其浓度为 960IU/ml(贮液)，再准备 5 个 稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 150 μL 的 标 准 品 稀 释 液 ， 如 图 所 示 依 次 倍 比 稀 释 成 960IU/ml,480IU/ml,240IU/ml,120IU/ml,60IU/ml,30IU/ ml,标准品稀释液(0IU/ml) 直接作 为空白孔。为保证实 验结果有效性，每次实 验请使 用新的标准品溶液 。

2. 加样 ：分 别设空白孔（空白对照 孔不 加样品及 酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶 标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μl，然 后再加待测样品 10μ（l样品最终稀释度为 5 倍） 。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻 轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后 置 37℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30 倍浓缩 洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释 后 备用。

5. 洗涤：小心揭 掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔 加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，

如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加 入酶标试剂 50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3 。

8. 洗涤：操作同 5。

9. 显色：每孔先加入 显色剂 A 50μl，再加入显色 剂 B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色 15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11. 测定：以 空白孔调零 ，450nm 波长依序 测量 各 孔的吸光度（OD 值）。测定应 在加终止液后 15 分钟 以内进行。

 注意事项：

1 ． 试 剂 盒 从 冷 藏 环 境 中 取出 应 在 室 温 平 衡 15-30 分钟后方可使用，酶标 包被板开封后

如未用完，板条应装入 密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中 加温助溶，洗涤时不影 响结果。

3．各步加样均 应使用加样器，并经常校对其准确性， 以避免试验误差。一次 加样时间

最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪 加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如 标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔 第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数 （n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总 稀释倍数（× n×5） 。

5．封板膜只限一次性使 用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须 以酶标仪读数为准 .

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处 理。

9．本试剂不同批号组分 不得混用。

计算：

以标准物的浓度为横坐 标，OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲 线，根据样品的 OD

值由标准曲线查出相应 的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓 度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程 式，将样品的 OD 值 代入方程式，计算出样 品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际 浓度。

 试剂盒性能：

1. 样 品 线性 回 归 与 预 期 浓 度 相 关 系 数 R 值 为 0.990 以上。

1.批内与批见应分别小于 9%和 11%

2.保存条件及有效期：

a.试剂盒保存：2-8℃。

b.有效期：6 个月