小鼠一氧化氮合成酶(NOS)

检测范围：

1μmol/L - 32μmol/L

使用目的：

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与 HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的

PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1. 标准品：其浓度为 64μmol/L(贮液)，再准备 5 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 150μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成 64μmol/L,32μmol/L,16μmol/L,8μmol/L,4μmol/L,2μmol /L,标准品稀释液(0μmol/L)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μ（l 样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3。

8. 洗涤：操作同 5。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A 50μl，再加入显色剂 B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间

最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（× n×5） 。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。

2.批内与批见应分别小于 9%和 11%

3.保存条件及有效期：

a.试剂盒保存：2-8℃。

b.有效期：6 个月