一站式柱式miRNA提取试剂盒（一站式柱式miRNAout）

产品及特点 本产品是在基因 miRNAout基础上自主开发的柱式 升级产品，是目前国内外市场上最快速最简单的小 RNA 分离纯化产品。它具 有下列特点：

1. 一步法直接分离纯化小 RNA，比两步法（先分离总 RNA 和再纯化其 中的小 RNA）和 PAGE 电泳回收法更简单。得到的小 RNA 长度大 部分在 200 nt 以下，包括 5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、 pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等。

2. 柱式操作，比 miRNAout 更加简单快捷，整个过程只需要十多分钟。

3. 适用范围广，可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。

4. 小 RNA 纯净，OD260/280 一般都在 1.9 以上。

5. 产率一般为 20-40 ug/100 mg 动物组织。

6. 无基因组 DNA 的污染。

7. 可用于 RT-PCR、miRNA 标记、microarray 等后续实验。

规格及成分：

运输及保存 常温运输和保存，有效期一年。

自备试剂 氯仿。

使用方法 由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理 100mg 左右的各种 组织，可以在 1.5 mL 塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于 微量提取的量进行，最后再收集在一起。

1. 新鲜配制裂解液。将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根据组织细胞 类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液 A 和溶液 B 混合后必须立即 使用，不要放置，否则会产生沉淀。 a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每 10 平方厘米细胞中加入 1mL 新鲜配制的 裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。 b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每 1-5×106 悬浮细胞中加入 1mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是 fibroblasts 或 carcinomacell，1mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要 超过 1×106 个细胞。 c)对新鲜的动物或植物实体组织：匀浆法：先将剪切成小块新鲜组织或液氮 保存的组织放入 10mL 或 15mL 塑料离心管中，每 50-100mg 组织加 1mL 新鲜配制的裂解液，用剪切式匀浆机匀浆 30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细 胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的 DNA），建议组织的使用 量不要超过 50mg/mL 裂解液，否则十分容易产生 DNA 污染。液氮研磨法： 将组织在液氮中研磨成粉，然后转移到新配制的裂解液中，震荡混匀。 d)对在 RNALOCKER 等非冻型保存液中保存的动物或植物实体组织组织： 先用纸吸去 RNALOCKER 液体后再剪切成小块，再按新鲜实体组织的处理 方法处理。

2. 将裂解物转移至一个干净的 1.5mL 塑料离心管中，然后加入 0.2 倍体积的 自备氯仿(1mL 裂解物需 0.2ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均 30 秒。

3. 12000-15000g 室温离心 3-5 分钟。

4. 将上清液（约 0.6-0.8mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相 和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。 为保险起见，可以留下 100uL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行， 否则容易吸出交界面的不可见的丝状 DNA。

5. 12000-15000g 室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA 将 与离心吸附柱的膜结合，小 RNA 将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的最 大吸附能力为 40ug 动物 RNA，20ug 植物 RNA，所以如果样品中的大 RNA 含量高于上面数值，则需要减少上样量，否则穿透液中将同时含有大 RNA 和 小 RNA。如果不减少上样量，也可以将穿透液再次重复上柱以去除大 RNA。 由于此时离心吸附柱已经吸附了大 RNA，所以需要提前对离心吸附柱进行预 处理（具体步骤见本手册最后的附录）。

6. 在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等体积的溶液 C，混匀。此时溶液 的总体积约 1.5mL。

7. 先转移约 0.75mL 到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分钟，弃收 集管中的穿透液。

8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分 钟，弃收集管中的穿透液。

9. 加 0.7mLmiRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半 分钟，弃穿透液。

10.加 0.3mLmiRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半 分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。

11. 12000-15000g 室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留 的 miRNA 专用洗柱液会影响 miRNA 的使用。

12.将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 收集管中，加入 30-50uLRNA 洗 脱液，室温放置 3-5 分钟。

13. 12000-15000g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 miRNA 样品，可以立 即使用或存放于-80℃待用。 附录：离心吸附柱反复上样去除大 RNA 的流程

1. 将结合有大 RNA 和 DNA 的宽口离心吸附柱中加入 0.1mL 自备的超纯水， 12000-15000g 室温离心半分钟，弃收集液。 2. 再加 0.1mL 自备的超纯水，重复上步一次。

3. 将第 5 步的得到、需要进一步去除其中大 RNA 和 DNA 污染的穿透液直接 上柱，12000-15000g 室温离心半分钟，收集穿透液（此穿透液含小 RNA）。

4. 如果大 RNA 已经去干净，可以直接进入第 6 步。一般样品只需要额外处理 一次就可以去除全部的大 RNA 污染。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。