柱式植物RNA提取试剂盒2.0（柱式植物RNAout 2.0）（含DNA酶)

产品及特点 本产品是基因柱式植物 RNAOUT与柱式 DNA 清除剂整合后得到的升级产品，它解决了提取的植物总 RNA 中 出现基因组 DNA 污染这一难题，提取的 RNA 通过 PCR 验证不含基因组 DNA 污染。该产品特点如下：

1. 操作简单快速，处理一个样品只需要约十几分钟。

2. RNA 纯度更高，平均 OD260/280 一般都在 2.0 左右，能够有效去除大 多数植物中的多糖污染。

3. 所提取 RNA 不含基因组 DNA 污染（电泳及 PCR 均检测不到）。

4. 得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。

5. 性价比高于进口的柱式植物 RNA 提取产品。

6. 本试剂盒方法提取不到总 RNA 中的 miRNA。

规格及成分：

运输及保存 常温运输和保存，但 RNase-free DNase 和 DNase 膜反应液需要-20℃保存， 有效期一年

自备试剂 氯仿

使用方法

1. 估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要 100-200 mg 植物叶片、 或 50-100 mg 植物种子、或 200-500 mg 植物果实。

2. 样品破碎： 1) 匀浆法：先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在 RNALOCKER 中的植物 组织需用纸吸去 RNALOCKER 液体后再剪切成小块)，放入 10-15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 A，然后用匀浆器 匀浆 5-20 秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。 2) 液氮研磨法（适用于复杂，易降解样品）：取适量新鲜植物组织放入 含液氮的研钵中，迅速将组织研磨成粉末后，将粉末转移到合适的塑 料离心管中，加入 1 mL 柱式植物 RNAOUT 溶液 A，立即剧烈振荡 20 秒，充分混匀。 注意：溶解柱式植物 RNAout 溶液 A 沉淀。如果把柱式植物 RNAout 溶液 A 放在 4℃放置，一段时间后可能会产生沉淀，此种情况下使用 前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。

3. 将匀浆物或研磨物转移至干净的 1.5 mL 塑料离心管中(可以不必转移非 液体的细胞碎片)。有的植物组织（比如果实）含有大量水份，匀浆液会 多于 1 mL，转移时也只取 1 mL。

4. 在离心管中加入0.3 mL的柱式植物RNAOUT溶液B和0.2 mL自备氯仿， 在振荡器上振荡 30 秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必 须使管底溶液震荡起来。

5. 室温 12000 rpm 离心 3-5 分钟，两相间将有约 5 毫米厚的细胞破碎物。

6. 将上清液(约 0.6 mL)转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中，下层有机 相和中间层含有 DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下 100 uL 上清液不取。

7. 加入跟上清液等体积的柱式植物 RNAOUT 溶液 C，充分颠倒混匀。如果有 沉淀产生（对某些植物，属于正常现象），千万不要去掉沉淀，一定要把 所有的混合物上柱。

8. 将一半的混合液（含沉淀物，如果有的话）转移到离心吸附柱中，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。

9. 将剩下的一半的混合液（含沉淀物，如果有的话）转移到同一离心吸附柱 中，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。 10. 加 0.7 mL 通用洗柱液，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。再加 0.3 mL 通用洗柱液，12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。一般样 品如此洗涤两次即可，但对于在第 7 步加入柱式植物 RNAOUT 溶液 C 后 有沉淀产生的样品，则需要洗三次，每次加入的通用洗涤液的量分别为 0.4、0.3 和 0.3 mL，其他操作不变。

11. 12000 rpm 室温离心 10 秒以便去除残留液体。此步很重要，否则残留 的通用洗柱液会抑制后续反应中 DNase 的活性。 12. 将 10 uL（10 U）的 RNase-free DNase 加入到 50 uL 37℃预热的 DNA 膜反应液中，吹打混匀配制成 DNase 工作液。 13. 将 DNase 工作液在 37℃预热 1 分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室 温放置 5 分钟。注意：5 分钟一般足够降解大多数情况下的 DNA 污染。 如果 DNA 没有彻底降解（可能由于样品中残留的杂质抑制了 DNase 的 活性），此步的保温时间可以适当延长到 10 分钟或 15 分钟。

14. 直接在离心吸附柱中加 0.7 mL 通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。

15. 12000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。

16. 再加 0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12000 rpm 室温离心半分钟， 弃穿透液。

17. 12000 rpm 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇（通用洗 柱液中的成分）会影响 RNA 的使用。

18. 将离心吸附柱转移到 RNase-free收集管中，加入30-50 uL RNA洗脱液， 室温放置 1-2 分钟。

19. 12000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品。本产品提 供的离心吸附柱吸附力较强，一次洗脱不能全部将膜上 RNA 洗下，如有 必要，可以再加入 30-50 uL RNA 洗脱液一次。

20. 所得 RNA 溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。如果要进行甲醛变性 电泳检测。如果使用非变性胶电泳，则必须使用 RNAon 上样液。千万不 能使用 DNA 上样液（因为它一般没经过去 RNase 处理）。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。