动物RNA提取试剂盒（动物RNAout）（TRIzol）

产品及特点 本产品是类似于 TRIzol、基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速总 RNA 提取试剂，可用于从各种动物组织（包括白细胞）和部分植物材料中 快速提取总 RNA。

1. 操作简单快速，只要 10 分钟左右，可以全在室温下进行。

2. RNA 质量高，OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以检测到的基因组 DNA 污染。

3. 适用于大部分实验材料，如培养细胞、各种动物材料和少数植物材料。 植物 RNA 的提取最好使用植物 RNAOUT。

4. 性价比高于进口 TRIzol 和 TRI Reagent 等同类产品。

规格及成分

运输及保存 常温运输，4℃保存，有效期一年。

自备试剂 氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。

使用方法 注意：下面的操作步骤是用 1 mL 本产品进行的微量提取的，细胞使用量一 定要准确，不能超过下述用量，否则将超出本产品的裂解能力，RNA 产量 将急剧降低。如果样品量大，请按比例增加各成份的用量。RNA 工作环境 最好用高效无毒的固相 RNase 清除剂彻底处理。

1. 对贴壁细胞（10 平方厘米）：吸尽培养液，加入 1 mL 的本产品用枪充 分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移至干净的 1.5 mL 塑料离 心管中，进入第 6 步。

2. 对悬浮细胞（五百万至一千万个）：离心收集细胞，吸尽液体，加入 1 mL 本产品，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的 1.5 mL 塑料离心管中，进入第 6 步。

3. 对新鲜组织（50-100 mg）：将新鲜组织剪切成小块，放入 10 mL 或 15 mL 塑料离心管中，加入 1 mL 的本产品，用 Polytron 剪切式匀浆 器冰上匀浆 30 秒左右，将匀浆液转移至新的 1.5 mL 塑料离心管中， 进入第 6 步。注意：对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细 胞中含大量正在复制的 DNA），使用量不要超过 30-50 mg，否则十分 容易产生 DNA 污染。对 10 mg 以下的组织，最好加入本公司的微量 RNA 助沉剂。

4. 对 RNALOCKER保存的组织（50-100 mg）：先用纸吸去 RNALOCKER液 体后再剪切成小块，其余操作同第 3 步。RNALOCKER 处理后的组织韧 性很强，匀浆时间需要适当延长。

5. 对液氮中保存的组织（50-100 mg）：在研钵中研磨成粉，加入 1 mL 本产品，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的 1.5 mL 塑料离心管中，进入第 6 步。

6. 在装有裂解物/匀浆物的 1.5 mL 塑料离心管中加入 0.2 mL 自备氯仿， 振荡器上充分振荡混均 30 秒。注意：一定要把官底的溶液震荡起来， 否则只是液面的振动。

7. 13000-15000 g 室温离心 3 分钟。

8. 将上清液（约 0.6 mL）转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。下 层有机相（蓝色）和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产 生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见，可以留下 50-100uL 上清液不取。

9. 对脂类丰富的组织（如脂肪组织和脑组织），需再重复氯仿抽提一到两 次以让氯仿充分去除脂类分子。

10. 在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡 30 秒混匀。

11. 13000-15000 g 室温离心 5 分钟，离心底的侧面将形成 RNA 沉淀。 如果组织使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率，可以将离心时 间延长到 20 或 30 分钟。 12. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。

13. 在含 RNA 沉淀的离心管中加入 1mL 75%乙醇，振荡混匀 30 秒。

14. 13000-15000 g 室温离心 1 分钟。

15. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。

16. 重复第 13-15 的洗涤步骤一次（也可以省略）。

17. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留乙醇(约 50 uL)。注意不要吸弃 RNA 沉淀。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响 RNA 的后续使用。

18. 室温放 1-2 分钟后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使 RNA 沉淀溶 解。千万不要用真空离心法使 RNA 沉淀过于干燥，否则 RNA 将变得 十分难溶。RNA 样品可以立即使用或存放于-80℃待用。 注意：由于 RNase-free 水没有主动灭活残留 RNase 的功能，而任何 方法提取的 RNA 都可能有残留的 RNase，所以强烈建议客户使用本公 司推出的具有主动灭活残留 RNase 功能的、同时跟后续 RT-PCR 等反 应兼容的液相 RNase 清除剂。 附一：RNA 完整性的电泳检测（仅供参考，本产品不含相关试剂） 如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是简单检测，可以使用 TAE 缓冲液或超快核酸电泳液 进 行 常 规电 泳 ，但 文献 报 道 必须 使用 RNAon 这 样 的变 性 上样 液 （BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也 没经过去 RNase 处理，所以最好不要使用，否则 RNA 容易降解。 动物 RNA 电泳后应该在 UV 下呈现三条清晰的 rRNA 带，28S rRNA 条 带的荧光强度一般比 18S rRNA 条带的荧光强度强 1.5-2.3 倍。如果这两 条 rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解（因为大的 RNA 被酶降解的可能更大）。 跟动物一样，植物果实和种子的 RNA 一般有三条电泳带，但植物叶片 的 RNA 有四条或更多 rRNA 带，多余的 RNA 来源于叶绿体。 如果电泳发现 RNA 样品中有 DNA 污染（一般是使用过多样品造成）， 可分别用非酶 DNA 清除剂或 RNase-free DNase 清除。 附二：RNA 产量和纯度测定（仅供参考，本产品不含相关试剂） 用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 缓冲液将 5-10 μL RNA 稀释 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 测光吸收，通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度×体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。RNA 的产率还随组织的营养状态和组织的种类不同而不 同，一般来说，代谢旺盛的组织(如肝脏和肾脏)RNA 的产率高，代谢不旺盛 的组织(如肌肉和脂肪组织)RNA 的产率低，下面是常见动物组织 RNA 产率: 肌肉，胎盘和脑组织:1-2 μg RNA/mg 组织 肝，胰和肾组织: 5-10 μg RNA/mg 组织 培养细胞: 5-15 μg/10E6 细胞 RNA 的纯度通过 OD260/OD280 来确定，一般在 1.8-2.1 之间即算 合格。但即使低于此范围，一般也不会影响 RT-PCR 等反应。 蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可 以用基因的多糖清除剂去除。 

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。