B载体

产品及特点
本产品是在基因G载体的基础上开发的专门用于高效快速克隆平末端DNA片段的专用载体,它是由Sma I酶切G载体后经过纯化得到的即用型线性载体。跟G载体一样，本产品带有自杀基因，Sma Ⅰ位点位于该基因之中，只有当外源平末端DNA插入片段插入Sma I位点,连接后的DNA转化的细胞才能生长,所以最后得到的转化子几乎都是含有平末端DNA插入片段的重组子。
1.即用性，可以直接用于连接反应，免去繁琐的酶切，电泳检测，纯化，去磷酸化，再纯化等步骤。
2.具有-G载体的所有优点，包括零背景,适用于所有E.Coli菌株，多拷贝的colEI型复制起始位点。
3.高效率，由于自杀基因的使用有效地减除了载体自身环化对平末端DNA克隆的影响，自身环化得到的转化子在有选择液存在时只占总转化子的1%-5%。

4．应用广泛，可用于克隆酶切产生的平末端 DNA，Pfu酶扩增的PCR片段，cDNA片段，3'和5'RACE片段, Taq酶扩增的PCR片段(部分为平末端)。

规格及成分

运输及保存低温运输，-20°C保存，有效期两年。

自备试剂

1﹒外源DNA片段。如果含又DNA片段的反应液中不含其他载体DNA
(如酶切反应液，PCR反应液)，可以不需要凝胶回收,灭活酶后即可直接将反应液用于连接反应。PCR引物5’端一般为OH基团，最好在PCR后用T4激酶磷酸化，否则连接效率极低。

2．感受态宿主菌。DH5a，DH10B或HB101等常用E. coli菌株。

3.连接反应试剂。请购买现成试剂盒。

4.选择培养基。在倒LB平板之前随产品赠送的选择液和Amp(如果附赠的选择液含Amp,则不必须额外加Amp)按比例加入到LB之中,使选择液终浓度为1X,Amp终浓度为50 ug/mL(如果附赠的选择液含Amp,稀释到1X后Amp的终浓度即为50 ug/mL),混匀后倒盘。

使用方法

1．连接反应
a.取新的经过灭菌处理的0.5 ml Eppendorf管，编号。
b.将100 ng载体DNA转移到无菌离心管中,加两倍摩尔量的外源DNA片段，折合成重量(ng)=(外源 DNA片段bp数X100 ngX2)/5330 bp(载体 DNA长度)
c.加蒸馏水至体积为8ul，于45℃保温5分钟，使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。平末端DNA片段的克隆可以省去45℃保温5分钟这一步。
d.加入10xT4 DNA ligase buffer 1pul,T4 DNA ligase 0.5 ul，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温1-24小时。
e.同时做只有外源DNA片段没有质粒载体的组对照反应。没有必要做只有质粒载体而无外源DNA 的对照组，因为自身环化的载体不能生长，能够生长的转化子基本上是两个载体分子相互连接形成的新载体。但在有两倍于外源DNA片段存在的情况下,两个载体分子连接的机率很小。

2.E.coli感受态细胞的转化
a.各取每组连接反应液2ul按标准方法转化E. coli感受态细胞。
b.每组连接反应转化原液取100 ul用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。