柱式病毒DNA提取试剂盒(柱式病毒DNAout)
产品及特点 本产品是在基因一管式病毒 DNAOUT 的基础上开发的、专门用于从血清(血浆)等液体样品及拭子(咽拭子、鼻拭子、口腔拭子、阴道拭子等)中提取微量病毒DNA 的产品,它具有下列特点:
1. 操作简单,整个过程只需要 20 分钟左右,不需要额外在洗柱液中补加乙醇。
2. 灵敏度高,通过 PCR 检测到的最终灵敏度可以达到 30-50 拷贝/mL。
3. 安全无毒,不需要使用苯酚和氯仿等有机溶液。
4. 如果加上病毒离心富集步骤,最多可以处理 1.5 mL 液体病毒样品。
5. 与 PCR 和荧光 PCR 兼容。
6. 价廉物美,性价比远高于国外同类产品。
7. 适用于各种材料,包括血清、血浆、脑脊液、尿液、粪便、培养细胞上清液等无细胞材料。
规格及成分
运输及保存 常温运输及保存,DNA 病毒裂解液长期(1 月以上)放置时需要放 4℃,有效期一年。
自备试剂 无,但需要自备 RNase-free 的 1.5 mL 离心管(耗材)。
使用方法 1. 如果有 N 个样品,标记 N+2 个 1.5-2 mL 螺旋盖塑料离心管(如 SarstedtCAT#:782.694.006),多出的一个为阳性对照,一个为阴性对照。为避免污染,建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做个标记,以在后续操作时区别向心面和离心面。然后在离心管中分别加入 0.2 mL 液体样品(血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等),阳性对照和阴性对照。
1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品,则将拭子放入 0.2mL 自备生理盐水中挤压出液体,然后取 0.2mL 进行提取。
1.2、 如果是粪便等半固定样品,则取约 0.3mL 的样品,加入 0.3mL 自备生理盐水,震荡重悬,离心取 0.2mL 上清进行提取。
1.3、 如果血液,细胞培养液等含细胞的液体,可以离心用上清,也可以直接取用,但后者提取的病毒 DNA 中会有少量细胞的基因组 DNA 污染(但不影响 PCR)。血浆的抗凝剂必须是 EDTA 或 ACD,不能是肝素。使用ACD 时由于所加入 ACD 会增加体积,样品会被稀释,得到的病毒滴度会比使用 EDTA 低 15%左右。血浆最好按 0.6mL/管的量分装保存,以避免反复冻融。
1.4、 如果样品是实体组织或培养细胞,则需要在自备生理盐水中匀浆后离心,用 0.2mL 上清液(含病毒)进行提取,但此种情况下最后得到的病毒DNA 不可避免的会含有少量基因组 DNA 污染(但不影响 PCR 检测)。1.5、 如果液体样品中的病毒需要富集,可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液体在 4℃ 24,000 g 冷冻离心 60 分钟, 移弃 1.3 mL、用剩下的 0.2mL 继续操作。
2. 加入 0.6 mL DNA 病毒裂解液到各离心管中,振荡 30 秒混匀后室温放置 10 分钟裂解病毒。注意:DNA 病毒裂解液在 4℃放置后可能会产生沉淀,使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 加入 0.8mL 上柱结合液到离心管中,颠倒混匀后转移一半的混合液(0.8mL)到离心吸附柱中,室温放置 2 分钟。
4. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟,弃收集管中的穿透液,把离心吸附柱放回到收集管中。
5. 将剩余的另外一半裂解液(0.8mL)转移到离心吸附柱中,室温放置 2 分钟。
6. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟,弃收集管中的穿透液,把离心吸附柱放回到收集管中。
7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中,12,000 rmp 室温离心 1 分钟,弃收集管中的穿透液,把离心吸附柱放回到收集管中。
8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中,12,000 rmp 室温离心 1 分钟,弃收集管中的穿透液,把离心吸附柱放回到收集管中。此为第二次洗涤,可以跳过。
9. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟(干甩),弃含穿透液的离心管。
10. 将干甩后的离心吸附柱套入到一个自备的 RNase-free 的 1.5 mL 离心管中,在离心吸附柱的滤膜的中部加入 30-100 uL DNA 洗脱液 3.0,然后室温放置 2 分钟。
11. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟,离心管中的溶液即为病毒 DNA 溶液。
12. DNA 样品可以直接用于 PCR,也可放-20℃长期保存。
注:病毒提取的核酸量远不足以电泳检测,提取后可通过 PCR 检测,最终灵敏度可以达到 30-50 拷贝/mL。
仅用于科研,不能用于临床诊断!所有产品仅供科研使用,不得用于人或动物的治疗等任何其他用途,不为任何个人提供产品和服务。