大提柱式质粒DNAout

产品及特点 本试剂盒是用于质粒 DNA 大量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处 理，再通过离心吸附柱，专一结合 DNA，最后洗去杂质，高效快速提取质粒 DNA，全套操作可以在 30 分钟之内完成。使用本试剂盒可从 50-100 mL 过 夜培养的菌液纯化得到高达300-500 ug的高纯度质粒DNA（OD260/OD280 = 1.8-2.0），可以直接用于酶切、转化、测序及 PCR 等。

1．快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。

2．纯度高，采用本试剂盒提取的质粒 OD 比值在 1.8-2.0 之间。

3．产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到 2-5 ug/mL。

4．用途广，适用于低拷贝和高拷贝质粒。 5．价格低，比多数国内同类产品的价格更便宜。

规格及成分：

运输及保存 RNase A 溶液需要低温运输、-20℃保存，其余成分可常温运输、室温保存， 如有沉淀可加热溶解后再使用。 

自备试剂 无。 使用方法

1. 用 250 mL 离心管收集 100-300 mL 菌液，5000 rpm 离心 10 分钟，去 除上清。

2. 往细菌沉淀中加入 5 mL 柱式质粒 DNAout 溶液 A，充分振荡悬浮（第一 次使用时需要将 RNase A 溶液全部加入到溶液 A 中并混合均匀，未用完的、 含 RNase A 的溶液 A 需放 4℃保存）。注意：充分重悬细胞沉淀使之无细 胞结块状物对于获得高的质粒产量十分重要。

3. 加入 5 mL 柱式质粒 DNAout 溶液 B，温和翻转 10 余次至蓝色变得均匀。 室温放置 5-10 分钟裂解细菌。注意: 避免剧烈振荡，否则细菌基因组 DNA 将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒 DNA。溶液 B 用后需要将盖 拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液 B 中 的碱，降低其效率。如果溶液 B 颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不 用并且速跟厂家联系。

4. 加入冰浴的 7mL 柱式质粒 DNAout 溶液 C，颠倒混匀，此时混合液应该 从蓝色变成无色，如果不发生颜色变化，则表示柱式质粒 DNAout 溶液 C 变质，需要联系厂家。将混合液冰上放置 10 分钟，将有白色絮状物形成。 注意不要过分振荡。

5. 6000 rpm 离心 10 分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提 高以充分沉淀絮状物。

6. 将上清液（约 20 mL）转移到离心吸附柱中，放入 50 mL 套管中。由于 此时的溶液比重较大，部分沉淀物悬浮在上清液中属正常，吸取上清时避 开漂浮的沉淀物即可。

7. 6000 rpm 离心 5 分钟，质粒 DNA 将与离心吸附柱中的膜结合。弃穿透 液。

8. 将 10 mL 通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置 2 分钟后 6000 rpm 离心 5 分钟，弃穿透液。

9. 重复上步一次，即将 10 mL 通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置 2 分钟后 6000 rpm 离心 5 分钟，弃穿透液。 10.室温 6000 rpm 空甩 5 分钟，弃穿透液。注意：此步对去除残留通用洗柱 液很重要，否则通用洗柱液会影响 DNA 的使用。

11.将离心吸附柱放入一个自备的、干净的 50 mL 塑料离心管中，加 0.5 mL DNA 洗脱液 2.0（洗脱液如加热到 50-65℃效果更佳），室温静置 2 分钟 后 6000rpm 离心 5 分钟，收集液即是质粒 DNA 溶液。

12.本试剂盒中的离心吸附柱吸附能力较强，所以再用 1 mL DNA 洗脱液 2.0 洗脱 3-4 次才能把绝大部分质粒 DNA 洗脱下来。得到的 RNA 可以收集在 一起立即使用或存放于-80℃待用。注：如果 DNA 洗脱液不够，可以用自 备的 DEPC 水代替。注：一般情况下，第一次洗脱可以洗脱约 25%的质粒 DNA；第二次洗脱可以洗脱约 35%的质粒 DNA；第三次洗脱可以洗脱约 20%的质粒 DNA；第四次洗脱可以洗脱约 10%的质粒 DNA；第五次洗脱 可以洗脱约 8%的质粒 DNA。

13.合并所得质粒 DNA，立即使用或-20℃储存。如果需要使用液相内毒素清 除剂清除质粒 DNA 中的内毒素，可以直接将此步所得的 DNA 溶液用于去 内毒素处理。如果 DNA 浓度太低，可以另购本公司的核酸浓缩剂进行浓缩。

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