柱式分枝杆菌DNAout

产品及特点 分枝杆菌属（Mycobacterium）是极为古老的细菌，与人类的疾病相关的就 有 25 种以上，包括引起结核病的结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）。 近年来由于多重耐药性分枝杆菌的出现，分枝杆菌再次成为人们关心的细菌。PCR 快速诊断是目前检测分枝杆菌的主流方法，但由于此类细菌具有十分独特的坚硬的 细胞壁，快速提取其基因组 DNA 一直是十分棘手的技术问题。本产品就是为解 决这一问题而开发，具有下列特点：

1. 操作简单，客户不需要准备额外的试剂。

2. PCR 检测灵敏度一般在 10-100 CFU/mL 样品。

3. 既可以使用培养的细菌，也可以使用痰液、精液、血液、脑脊液等样品

4. 价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜 5. 安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味 6. 本产品只能用于科研。

规格及成分：

运输及保存 常温运输及保存，但化痰液成分（干粉）需要低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 TE 缓冲液，氯仿。 操作方法 注意：文献报道部分分枝杆菌在 DNA 提取过程中还有形成菌落的能力，所以任 何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待，并严格按有关要求进行消毒处 理。 一: 培养的分枝杆菌样品的预处理

1. 刮取培养的分枝杆菌到 0.5 mL 自备 TE 缓冲液中。

2. 80℃放置 20 分钟以杀灭细菌。

3. 3000 g 室温离心 15 分钟，弃上清。

4. 将细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组 DNA 提取步骤。 二: 含分枝杆菌的痰液样品的预处理

1. 将痰液样品(0.5mL-2mL)加入到干净的 10 mL 或 15 mL 塑料离心管中。

2. 加 2mL 的自备蒸馏水，在加入 100mg 化痰液干粉，充分混合均匀后室温放 置 15-30 分钟。如果痰很浓，可以延长保温时间。

3. 3000 g 室温离心 15 分钟，弃上清。

4. 将细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组 DNA 提取步骤。 三: 含分枝杆菌的血液样品的预处理

1. 用自备红细胞裂解液对血液进行红细胞裂解处理（可另购本公司红细胞裂解液 产品，产品编号 60403）。

2. 将得到的白细胞沉淀放-20℃或更低温度放置 10 分钟。

3. 迅速将得到的白细胞沉淀 100℃加热 10 分钟。

4. 上述处理将使大部分白细胞破裂，加入自备的 TE 到离心管体积的一半位置。 此步使白细胞的 DNA 进入缓冲液中。

5. 离心 5-10 分钟沉淀细菌，离心速度取决于离心管的大小。如果样品在 1.5 mL 离心管，则可以 12000-15000 g 室温离心。如果样品在 10-15 mL 离心管，则 3000-5000 g 室温离心。

6. 吸弃上清(含白细胞 DNA)，将所得细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌 基因组 DNA 提取步骤。 四: 分枝杆菌菌基因组 DNA 的提取

1. 将 150 uL 65℃预热过的柱式分枝杆菌 DNA 提取溶液 A 加到有分枝杆菌 沉淀的螺旋盖离心管中，充分震荡混匀。

2. 将细菌和溶液 A 的混合物转移到一个干净的 1.5 mL 塑料螺旋盖离心管中。 强烈建议不要使用压盖式塑料离心管，否则后面处理过程溶液容易漏出。

3. 加入 300 uL 柱式分枝杆菌 DNA 提取溶液 B 和 300 uL 自备氯仿，充分 震荡混匀。

4. -20℃放置直到液体凝固，一般需要 20-60 分钟。过夜放置也可。

5. 放室温融化后振荡半分钟。

6. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟。

7. 小心转移全部上清到一个新离心管中，加入等体积的柱式分枝杆菌 DNA 提取 溶液 C，颠倒混匀。

8. 将液体转移到离心吸附柱中，室温放置 2 分钟。

9. 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。

10. 加入 0.5 mL 通用洗柱液 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。

11. 重复上步的洗涤过程一次。

12. 短暂离心半分钟。此步不要省略，否则残留的洗柱液（含乙醇）将会影响 DNA 电泳、酶切和 PCR 等反应。

13. 将离心吸附柱转移到一新的离心管中，加入 30-100uL DNA 洗脱液 2.0， 12000-15000 g 室温离心半分钟，所得溶液即基因组 DNA。

14. 直接取 5-10 uL 电泳检测 DNA，其余放冰箱备用或用于后续反应。

背景资料

按细菌系统分类，分枝杆菌属于 G+细菌，但为适应巨噬细胞内的生活环境，形成 了十分特殊的细胞壁，其靠近细胞膜的部分是其他 G+细菌都具有的肽聚糖 （peptidoglycan）层，该层通过磷酸二酯键与分枝酸-阿拉伯半乳糖-肽聚糖复合 层（MAPc，mycolyl-arabionogalactan -peptidoglycan complex）共价连接。 分枝酸是含 70～90 个碳原子的枝链脂肪酸，位于 MAPc 的外层，分枝杆菌因 此而得名。MAPc 层之外为糖化脂质层（glycolipid），它与分枝酸相连，成分主 要是磷脂，占细胞壁干重的比例高达 60%，所以分枝杆菌疏水性很强，不能使用 革兰氏染 色 。 分 枝 杆 菌 细胞壁 还 含 有 贯 穿 整 个 细胞壁 的 脂 阿 拉 伯 糖 甘 露 聚 糖（lipoarabinomannan, LAM），它是一种含阿拉伯糖和甘 露糖的磷酸化的、不均一混合物，其末段所连接的成分的不同与细菌对巨噬细胞反 应的不同密切相关。

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