柱式动物线粒体DNA提取试剂盒，PCR级（柱式动物线粒体DNAout）

产品及特点 线粒体 DNA（mtDNA）是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料， 但传统的两步式 mtDNA 提取方法是先温和裂解细胞，分离线粒体，然后再从 线粒体中提取 mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制，需要 针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点，具有下列优点：

1. 不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。

2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。

3. 每 107个动物细胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克组织一般能得 到 3-5 ug mtDNA。

4. 注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体 DNA 一般都十分巨大，非常难提。

规格及成分：

运输及保存 常温运输，短期可以在室温放置；长期保存最好放 4℃。

自备试剂 无

使用方法 一：培养细胞预处理

1. 用自备的 0.25%胰酶消化液处理约 107个培养细胞，离心收集后弃上清。

2. 用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤细胞两次，离心得到的细胞沉淀直接用于 mtDNA 提取。 二：组织细胞预处理

3. 用剪刀将 1g 新鲜的动物组织剪碎（芝麻大小最好），转移到 1.5mL 塑料 离心管中，用于 mtDNA 提取。注意：最好不要使用冻存的动物组织，因 为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破，使其 DNA 释放出来被胞浆中 的 DNA 酶降解，影响回收率。 三：血液预处理

4. 将 3-5 mL 抗凝外周血静置 30 分钟或低速离心 5 分钟，取白细胞层。

5. 用自备 PBS 洗涤白细胞两次，得到的白细胞沉淀用于 mtDNA 提取。 四：mtDNA 提取 5. 在细胞沉淀或剪碎的组织中加入 250 uL 冰浴的溶液 A，充分吹打分散。 如果是剪碎的组织，不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。

6. 加入 250 uL 常温的溶液 B（如果溶液 B 有沉淀，用前须 37℃加热溶解 后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀 10 次。千万不要剧烈振荡。

7. 冰上放置 6-8 分钟。注意不要超过 8 分钟。

8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C，温和混匀 4-6 次，可见白色沉淀物产生，然 后放冰上放置 20-25 分钟。

9. 室温 12000-15000 g 离心 10 分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。 由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避 开漂浮的沉淀即可。

10. 静置 5 分钟以让 DNA 与离心吸附柱充分结合，此步十分重要。

11. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟，弃收集管中的废液。

12. 加入 500 uL 的通用洗柱液，室温 12000-15000 g 离心 1 分钟，弃收集 管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙 醇会挥发。

13. 重复上步 1 次。

14. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则 残留乙醇会影响 DNA 的后续使用（如 DNA 上样时不能沉淀到加样孔中）。

15. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 mL 塑料离心管中，加入 30-50 uL 65-80℃预热的 DNA 洗脱液，室温放置 2 分钟。常温的 DNA 洗脱液也可 以用于洗脱，但产量稍微有所降低。

16. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟，离心管底溶液即 mtDNA。

17. 由于本公司离心吸附柱结合 DNA 能力较强，如果再加 30-50 uL DNA 洗 脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多 mtDNA（相当于第一次洗脱 的 20-30%），但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液来洗脱。

18. 12000-15000 g 离心 1 分钟，离心管底溶液即线粒体 DNA。每 107个动 物细胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克组织一般能得到 3-5 ug mtDNA。如果 DNA 需要浓缩，可以使用本公司的核酸浓缩剂。

19. 由于 DNA 机械断裂，电泳时 DNA 可能不呈现专一的带，但此 mtDNA 溶 液可以直接用于 PCR。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。