DNA甲基化修饰试剂盒

产品及特点 本产品是亚硫酸氢盐 DNA 修饰试剂盒的升级版，亚硫酸氢盐修饰 DNA 时要求 DNA 必须在单链状态，反应还必须在低温进行，常规的修饰试剂盒由于是在液相进行，要在低温下让 DNA 不相互复性而保持单链状态非常棘手，所以常规修饰试剂盒的修饰效率一般都不高。此外，常规方法要切换反应液，有多次沉淀步骤，使得DNA 的回收率一般都不超过 50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此产品，它具有下列特点：
1．用包埋的样品进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
2．免去了 DNA 提取过程，所需实验材料比常规方法更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。
3．包埋处理后，DNA 在整个操作过程中都处于最适于修饰的单链状态，提高了修饰效率。
4．DNA 包埋于包埋块中，切换反应液非常方便，而且 DNA 不会丢失，所以最终回收率都在 90%以上。
5．适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的 DNA 样品。

6．本试剂盒足够制备 150 多个10uL 包埋块（如果用纯化好的 DNA）或 25 个 10uL包埋块（如果用悬浮细胞）。

规格及成分

自备试剂 超纯水
运输及保存 常温运输及保存,蛋白酶 K 溶液、包埋液和包埋块裂解液需低温运输，-20℃保存。有效期一年。
使用方法 一：准备试剂 
1. 在装有 2.3g 沙甲基化修饰溶液 B（简称溶液 B，下同）成分一干粉的瓶中加入3.9 mL 水和 0.9 mL 沙甲基化修饰溶液 A（简称溶液 A，下同），摇晃溶解得到4.8 mL 溶液 B 成分一。
2. 在装有 110mg 溶液 B 成分二干粉的离心管中加入 1 mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液 B 成分二。
3. 将 0.6 mL 溶液 B 成分二加入到 4.8 mL 溶液 B 成分一中，得到 5.4 mL 溶液 B，冰上放置待用。未用完的溶液 B 下次不得再使用。
4. 每次实验前，将装有 1.5 mL 包埋液的离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放 80℃待用。
二、对微量组织材料（如果材料足够，可先纯化 DNA，再直接进入第三步）
1. 用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过 60 个细胞/uL的单细胞 PBS 悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液（如卵细胞），则 PBS 洗涤后直接离心沉淀，再重悬在 PBS 中（浓度不超过 60 个细胞/uL）。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂，如胰酶消化液和 PBS。
2. 在一个自备的 2 mL 离心管中加入 3 uL 上步所得细胞悬液，再迅速滴加 7 uL 在80℃预热的包埋液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
3. 加入 500 uL 分子生物学级石蜡油，短暂离心后将离心管在沸冰浴中放 20 分。
4. 将离心管转移到冰上放置 30 分钟，低温下包埋液和细胞混合液将凝固成 10uL 的包埋块，包埋块中将包含细胞的基因组 DNA 和蛋白质组份。
5. 在包埋块中加入 500 uL 包埋块裂解液和 5 uL 蛋白酶 K 溶液（10mg/mL），短暂离心后 37℃保温过夜，降解其中的蛋白质组份。
6. 吸弃包埋块之外的所有溶液（包括石蜡油），用 1mL TE 缓冲液室温浸泡包埋块 2 次，每次 15 分钟。此步可去除残留包埋块裂解液和残留的蛋白酶 K。
7. 酶切包埋块中的基因组 DNA：选定不识别 PCR 靶片段的内切酶（本试剂不提供该相关试剂），再用 100 uL 选定内切酶的 1×缓冲室温液浸泡包埋块 15 分钟，吸弃缓冲液后再加入 100 uL 选定内切酶的 1×缓冲液和 50U 内切酶，37℃保温 2 小时。
8. 吸弃内切酶反应液，再加入 500 uL 新鲜配制的处理液 A（配制方法：100 uL 溶液A+400 uL 超纯水）室温放置 15 分钟，重复此步一次。此时 DNA 将呈单链。
9. 吸弃处理液 A 后，用 1 mL 新鲜配制的处理液 B（注：不是溶液 B，配制方法：50uL溶液 A+950 uL 超纯水）室温浸泡包埋块 5 分钟。
10.吸弃处理液 B 后，加入 750uL 石蜡油，然后沸水浴 20-30 秒，使 DNA 单链彻底彼此分开。
11.将离心管转移到冰上放置 30 分钟使包埋块重新凝固，单链 DNA 将固化。
12.在离心管中加入 1mL 预冷的溶液 B，短暂离心后继续在冰上放置 30 分钟。此步用于修饰固化的单链 DNA。
13.将离心管转移到 50℃放置 3.5 小时。
14.吸弃溶液 B，用 1mL TE 缓冲液常温洗涤包埋块 2 次，每次 15 分钟。
15.吸弃 TE 缓冲液，用 500 uL 新鲜配制的处理液 C（50 uL 溶液 A+450 uL 超纯水）常温洗涤包埋块 2 次，每次 15 分。
16.吸弃处理液 C，用 1 mL TE 缓冲液常温洗涤包埋块 3 次，每次 10 分钟.
17.吸弃 TE 缓冲液，所得包埋块可以在 4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次（每次 15 分钟）后直接用做 100uL 体系甲基化 PCR 的模板。
三、对纯化好的 DNA
18. 如果是纯化好的 DNA，直接选用不识别 PCR 靶片段的合适内切酶酶切纯化的DNA（本试剂不提供所需试剂），总体积不超过 20uL，DNA 不超过 700 ng。
19. 酶切结束后，沸水浴 5-10 分钟灭活内切酶并变性 DNA。
20. 冰上放置并短暂离心数秒后，再加入 4 uL 溶液 A，50℃保温 15 分钟。
21. 迅速加入 50 uL 在 80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
22. 在一个新的 2 mL 离心管中，加入 1 mL 预冷的溶液 B，再加上 750 uL 石蜡油，短暂离心后将离心管放冰上预冷。
23. 迅速取 80℃保温的混合液 10uL（第 21 步），用在空中滴加的方式加到第 22 步准备的预冷离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成一个包埋块。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
24. 再重复上步操作 6 次（步骤 23），共可以得到 7 个包埋块（约含 100ng DNA）。
25. 将离心管（含 7 个包埋块）继续放冰上 30 分钟进行修饰。
26. 后续操作同第 13-17 步。

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