高纯度质粒DNA小量提取试剂盒

产品组成

保存条件

常温（10~25℃）保存 12 个月，加入 RNase A 后的 Buffer P1 置于 2~8℃保存。

产品简介

本试剂盒采用改良的 SDS-碱裂解法，结合先进的硅胶膜吸附技术，可达到快速纯化质粒 DNA 的目的。适用于从 1~4 mL 的细菌培养物中提取多至 20 μg 高纯度的质粒 DNA，提取的质粒 DNA 可用于酶切、PCR、测序、细菌转化、体外转录与翻译等分子生物学实验。

产品特点

操作简便：在 30 min 内可完成多个样品的质粒 DNA 提取；

高效：可提取菌体 85%以上的质粒 DNA。

适用范围

本品适用于从 1~4 mL 的细菌培养物中提取多至 20 μg 高纯度的质粒 DNA。

注意事项

1. Buffer P1 在使用前先加入 RNase A（试剂盒中提供的 RNase A 全部加入），混匀后置于 2~8℃保存；

2. 第一次使用前，向 Buffer W1 中加入无水乙醇，加入量参见瓶上标签；

3. 当环境温度低时，Buffer P2 中的 SDS 可能出现浑浊或析出沉淀，将其 37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，请勿剧烈摇晃，以免形成泡沫；

4. Buffer P3 中含刺激性溶液，操作时要戴乳胶手套、口罩和眼镜。若沾染皮肤、眼睛应立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时及时就医；

5. 各溶液使用后请立即盖紧盖子；

6. 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

使用方法

1. 向吸附柱 EC 中加入 250 μL Buffer BL，12,000 ×g 离心 1 min，活化硅胶膜；

2. 取 1~4 mL 过夜培养的菌液，12,000 ×g 离心 1 min，收集菌体，尽量吸除上清；

3. 加入 250 μL Buffer P1（请先检查是否已加入 RNase A）重悬菌体沉淀（若菌体沉淀未彻底悬浮会影响裂解效果，导致提取得率和纯度偏低），涡旋震荡至无菌块为止；

4. 加入 250 μL Buffer P2，温和地上下翻转 6~8 次，使菌体充分裂解；

注意：此步需要温和翻转，不能剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，使提取的质粒中含有基因组 DNA 片段。混合后菌体应变得清亮粘稠，若未变得清亮，可能是由于菌体量过多，裂解不充分导致，应减少菌体量。

5. 加入 350 μL Buffer P3，温和地上下翻转 6~8 次，充分混匀（此时会出现白色絮状沉淀），12,000×g 离心 10~15 min；

6. 小心吸取上清，将上清转入吸附柱 EC 中（注意不要吸出沉淀），12,000 ×g 离心 1 min，弃废

液，将吸附柱 EC 放回空收集管；

7. 在吸附柱 EC 中加入 700 μL Buffer W1（请先检查是否已加入指定体积的无水乙醇）12,000 ×g 离心 1 min，弃废液；

8. 重复步骤 7；

9. 将吸附柱 EC 放回空收集管中，12,000 ×g 离心 2 min；

10. 取出吸附柱 EC，放入干净的 1.5 mL 离心管中，20~25℃静置 2 min，使残留的乙醇挥发。在吸附膜的中间部位加入35~50 μL Elution Buffer（60~65℃预热Elution Buffer效果更好），20~25℃静置 2 min，12,000 ×g 离心 2 min。如需较多量 DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱 EC中，离心 2 min。

注意：洗脱体积越大，洗脱得率越高，如需得到较高浓度的 DNA，可以适当减少洗脱体积，但最小体积不应少于 25 μL，体积过小会降低 DNA 洗脱得率，降低产量。洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，建议 ddH₂O 洗脱，并保证其 pH 值在 7.0~8.5 范围内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率；且 DNA 产物应保存在-20°C，以防 DNA 降解。

常见问题与解决办法

Q1：质粒 DNA 产量低？

A1：

1) 质粒拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有 2 ~3 倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为 3 - 16 μg）。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为 0.5~2 μg；

低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；

高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T。

2) 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量；

3) 细菌未充分裂解。细菌须在 Buffer P1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量；

4) 试剂准备有误。Buffer P2 若有沉淀析出需加热溶解，Buffer W1 加入乙醇体积不准确；

5) 洗脱效率低。将 Elution Buffer 预热至 60~65℃，并进行二次洗脱。

Q2：质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染？

A2：

1) 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在 12 ~16 h；

2) 裂解问题。加入 Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入 Buffer P2 时算起，总时间不要超过 5 min。

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