辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD⁺是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的 NADH 经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧, 在合成 ATP 的同时,形成大量的 ROS,同时 NADH 再生为 NAD⁺。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外,NAD⁺降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD⁺和 NADH,NADH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值;而 NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。
需自备的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 3 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂五:液体 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD⁺和 NADH 的提取:
1 血清(浆)中 NAD⁺和 NADH 的提取
NAD⁺的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NAD⁺和 NADH 的提取:
NAD⁺的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD⁺和 NADH 的提取:
NAD⁺的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(10⁴ 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液), 超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(10⁴ 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液), 超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

混匀,取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。
注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD⁺测定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH 测定中△A(A2-A1)≤0.0222,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.
NAD⁺和 NADH 含量的计算:
(一) NAD⁺含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302,R² = 0.9978;其中 y 为△A,x 为 NAD+浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NAD⁺含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺(nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD⁺(nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+(nmol/10⁴ cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)
(二)NADH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中 y 为△A,x 为 NADH 浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10⁴ cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注 意: 检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。