考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒说明书

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理：

在酸性溶液中，考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在 620nm 处有最大吸收峰，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品：

离心机、酶标仪、96 孔板、移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 11 mL×1 瓶，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取：

1. 液体样品：澄清液体样品可以直接测定。

2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：20 的比例（建议称取约 0.05 g 组织，加入 1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1. 酶标仪预热 30 min。

2. 在 96 孔板中加入：

注意：

1、 空白管只需要测定一次。

2、 测定管的待测样品蛋白质浓度要控制在 1-100μg/mL 范围内，尽量控制在中间范围。

3、 测定管若出现浑浊或分层现象，就说明蛋白含量较高，通常须将待测液用提取液稀释10~20 倍后重新检测。

计算公式：

标准曲线：y = 7.1265x - 0.0007；R² = 0.9997；x: 蛋白标准品浓度(mg/mL；线性范围为 0.001~0.1mg/mL)； y: 吸光值差值

1.按液体样本体积计算：Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷7.1265

                                                             =0.1403×(△A+0.0007)

2.按组织样本质量计算： Cpr（mg/g 鲜重）=(△A+0.0007)÷7.1265×V 总÷W

                                                                   =0.1403×(△A+0.0007)÷W

V 总：提取液体积，1 mL; W：样本质量，g。

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