果胶甲酯化程度测试盒说明书

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

植物细胞壁中的果胶是植物初生细胞壁的主要成分，除了起结构支撑、物质运输等作用外，还具有抵抗逆境的作用。果胶甲酯化程度影响了细胞壁的坚韧程度及其抗性。 

测定原理

果胶甲酯键经皂化处理后释放出甲醇，甲醇被醇氧化酶转化为甲醛，与 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑反应生成紫红色物质，在 550nm 下测定吸光值；同时半乳糖醛酸在 70℃下与浓硫酸反应生成5-甲酰基-2-呋喃甲酸，5-甲酰基-2-呋喃甲酸与 3,5-二甲基苯酚反应产生有色物质，在 450nm 下有最大吸光值。以甲醇生成量与半乳糖醛酸含量的比值代表果胶甲酯化程度。 

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、蒸馏水、95％乙醇、硫酸。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 1.5mL 试剂三溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；

试剂五：粉剂×2 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 试剂一充分溶解待用，现配现用。

试剂六：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。

试剂七：液体 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。

样本前处理

称取约 0.1g 组织，加入 1mL95%乙醇，进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。沉淀中加入 1mL 蒸馏水，充分震荡混匀后，10000g 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。沉淀中加入1mL提取液，混匀后 90℃水浴 2h，冷却至室温，10000g4℃离心 10min，取上清待测。 

测定操作表

1.甲醇生成量测定

计算公式

1.甲醇生成量计算

标曲为 y = 0.3954x + 0.0011，R² = 0.9999；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A1。

甲醇生成量（μmol/g）=（ΔA1-0.0011） ÷0.3954÷W×V 样总

                                    =2.53×（ΔA1-0.0011）÷W

2.半乳糖醛酸含量计算

标准曲线为 y = 0.2585x - 0.1746，R² = 0.9986；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A2。

半乳糖醛酸（μmol/g）=(ΔA2+0.1746) ÷0.2585÷W×V 样总

                                    =3.87×(ΔA2+0.1746)÷W

果胶甲酯化程度（%）=甲醇生成量÷半乳糖醛酸含量×100%

V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g。

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