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上手蛋白定量实验,我们有招儿

蛋白定量是生物学研究中不可能或缺的一个步骤,根据其目的可分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白的“个别定量”。在蛋白质的提取、纯化和分析过程中,蛋白质的定量随处可见。比如在裂解细胞之后,应对各个样品中的蛋白进行定量,确保下游实验的数据平行度;在电泳之前进行定量,保证上样量一致,这样目的条带含量的变化才有说服力。


蛋白质的结构复杂、种类繁多、功能各一、分子量存在巨大差异,目前还没有一个理想且通用的蛋白定分析方法。如今最常见的方法主要有以下几种:


BCA法测定

bicinchonininc acid
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原理

BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂,混合一起即成为苹果绿,即 BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时,蛋白质将Cu2+还原为Cu+,一个Cu*螯合二个BCA分子,工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物,最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

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特点

  1. 灵敏度高,检测浓度下限达到25ug/ml,最小检测蛋白量达到0.5ug,待测样品体积为1-20ul 。


  2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton x-100,5%的Tween 20,60, 80。


  3. 在20-2000ug/ml浓度范围内有良好的线性关系。


  4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。


  5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM疏基乙醇低于1mm。


  6. BCA法和Commassie法各有优势,在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用,以消除定量的误差。


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优缺点

  1. 操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便;

  2. 准确灵敏,试剂稳定性好,BCA 试剂的蛋白质测定范围是20-200ug/ml ,微量BCA测定范围在0.5-10ug/ml。

  3. 经济实用,除试管外,测定可在微板孔中就进行,大大节约样品和试剂用量;

  4. 抗试剂干扰能力比较强,如去垢剂,尿素等均无影响

考马斯亮兰法

bradford
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原理

考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含

量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比 Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000ug/ml ,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

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优缺点

优点:

  1. 灵敏度高,据估计比 Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质–染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。

  2. 测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。

  3. 干扰物质少。如干扰 Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

缺点:

  1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用v一球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

  2. 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton x-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N 的酸干扰 Lowary法一样)

  3. 标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

紫外分光光度法测定

bradford
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原理

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm波长处,在最大吸收波长处,吸收光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯-比尔定律,故可作为蛋白质定量测定的依据。

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优缺点

优点:方法简单、灵敏、快速、高选择性,且稳定性好,不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。


缺点:仪器昂贵,而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的,测定结果存在着一定的误差,受光源、溶液的PH值、比色皿材质、缓冲介质溶液等因素的影响和限制。

Lowary蛋白定量法

Lowary
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原理

Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展,其原理是:蛋白质溶液用碱性铜溶液处理,形成铜-蛋白质的络合盐,在加入酚试剂后,除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此,Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍,为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强,从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

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优缺点

优点:微克级高灵敏度定量测定,稳定。


缺点:

  1. 受植物体内存在的酚类物质干扰。

  2. 去污剂如TritonX-100,SDS,NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。


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