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斑马鱼总三碘甲状腺原氨酸(TT3) ELISA 试剂盒 XY-TT3-Zebrafish

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斑马鱼总三碘甲状腺原氨酸(TT3)

(96T)

检测范围:1 pmol/L。


使用目的:本试剂盒用于测定斑马鱼血清、血浆及相关液体样本中总三碘甲状腺原氨酸(TT3)含量。


实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中斑马鱼总三碘甲状腺原氨酸(TT3)水平。用纯化的斑马鱼总三碘甲状腺原氨酸(TT3)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入总三碘甲状腺原氨酸(TT3),再与 HRP 标记的总三碘甲状腺原氨酸(TT3)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的总三碘甲状腺原氨酸(TT3)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中斑马鱼总三碘甲状腺原氨酸(TT3)浓度。


试剂盒组成:

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样本处理及要求: 

  1. 血清:室温血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分) 。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

  2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心 20 分 钟 左 右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

  3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

  4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

  5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

  6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.

  7. 不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。


操作步骤:

  1. 标准品:其浓度为 80 pmol/L(贮液),再准备 5 个稀释标准品的 EP 管,每个 EP 管中加入 150μL 的标 准 品 稀 释 液 , 如 图 所 示 依 次 倍 比 稀 释 成 80pmol/L,40pmol/L,20pmol/L,10pmol/L,5pmol/L,2.5pmol/L,标准品稀释液(0pmol/L)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性,每次实验请使 用新的标准品溶液

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  2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl,然后再加待测样品 10μ(l 样品最终稀释度为 5 倍) 。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

  3. 温育:用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

  4. 配液:将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用。

  5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。

  6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50μl,空白孔除外。

  7. 温育:操作同 3。

  8. 洗涤:操作同 5。

  9. 显色:每孔先加入显色剂 A 50μl,再加入显色剂 B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色 15 分钟.

  10. 终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色) 。

  11. 测定:以空白孔调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。


注意事项: 

  1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

  2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

  3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

  4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5) 。

  5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

  6. 底物请避光保存。

  7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

  8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

  9. 本试剂不同批号组分不得混用。


计算: 

以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 


试剂盒性能: 

  1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990以上。

  2. 批内与批见应分别小于 9%和 11%

  3. 保存条件及有效期:

    a.试剂盒保存:2-8℃。

    b.有效期:6 个月


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