斑马鱼总甲状腺素(TT4) ELISA 试剂盒

(96T)

检测范围：60pmol/L -2200 pmol/L

使用目的：本试剂盒用于测定斑马鱼血清、血浆及相关液体样本中总甲状腺素(TT4)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中斑马鱼总甲状腺素(TT4)水平。用纯化的斑马鱼总甲状腺素(TT4)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入总甲状腺素(TT4)，再与 HRP 标记的总甲状腺素(TT4)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的总甲状腺素(TT4)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中斑马鱼总甲状腺素(TT4)浓度。

试剂盒组成：

样本处理及要求： 

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分 钟 左 右（2000-3000 转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1. 标准品：其浓度为 4000 pmol/L(贮液)，再准备 5个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 150μL的 标 准 品 稀 释 液 ， 如 图 所 示 依 次 倍 比 稀 释4000pmol/L,2000pmol/L,1000pmol/L,500pmol/L,250pmol/L,125pmol/L,标准品稀释液(0pmol/L)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使 用新的标准品溶液。

   

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μ（l 样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3。

8. 洗涤：操作同 5。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A 50μl，再加入显色剂 B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟.

10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项： 

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5） 。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

计算： 

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

试剂盒性能： 

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990以上。

2. 批内与批见应分别小于 9%和 11%

3. 保存条件及有效期：

   a.试剂盒保存：2-8℃。

   b.有效期：6 个月